作者：申新 于良 张靖 李胜男 潘承恩

作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院：1麻醉科，2肝胆外科，3妇产科，陕西 西安 710061

【摘要】  目的： 探讨白藜芦醇(Res)对宫颈癌C33A，SiHa和HeLa细胞增殖与凋亡的影响. 方法: MTT法检测不同浓度Res对C33A，SiHa和HeLa细胞的抑制率. 流式细胞仪检测细胞的凋亡率及细胞周期. 荧光显微镜观测凋亡细胞. 结果: Res在一定浓度范围内，以浓度和时间依赖的方式抑制宫颈癌C33A，SiHa 和HeLa细胞的生长（P<0.01）. 荧光显微镜下细胞呈现典型的凋亡性改变. Res对细胞周期无明显影响. 结论： Res通过诱导细胞凋亡以时间依赖和浓度依赖的方式抑制宫颈癌C33A，SiHa和HeLa细胞的生长.

【关键词】  白藜芦醇；宫颈肿瘤；细胞凋亡；细胞增殖

 0引言

白藜芦醇（Resveratrol, Res）是广泛存在于葡萄、果类、虎杖等多种食物、药用植物中的一种多酚类化合物. 研究表明，Res具有广泛的预防和抗肿瘤作用，它对白血病、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、结肠癌、鼻咽癌、喉癌、甲状腺癌等多种癌瘤细胞具有明显的抑制作用［1-6］. 但目前对Res抑制宫颈癌的研究还远未深入. 宫颈癌(cervical cancer)是最常见的女性生殖道肿瘤，高居发展中国家女性肿瘤发病率的首位. 研究发现，宫颈癌的发生与人乳头瘤病毒（human papilloma virus HPV）感染密切相关，本实验选择3种宫颈癌细胞株，即宫颈腺癌细胞株HeLa、宫颈鳞癌细胞株SiHa和C33A，其中HeLa和SiHa为 HPV阳性的细胞株，C33A为HPV阴性的细胞株. 研究Res对人宫颈癌细胞株的增殖与凋亡的影响，旨在探讨Res对宫颈癌潜在的治疗作用.

1材料和方法

1.1材料人宫颈癌细胞株C33A，SiHa和HeLa由西安交通大学医学院实验医学中心惠赠；Res购自Sigma公司，纯度99%；RPMI1640培养基购自Invitrogen公司；MTT购自Amressco公司；DMSO购自天津巴斯夫化工有限公司；Annexin V荧光试剂盒购自晶美生物技术有限公司.

1.2方法

1.2.1细胞培养人宫颈癌C33A，SiHa和HeLa细胞，在含100 mL/L胎牛血清，1×105 U/L青霉素、链霉素的RPMI1640培养液中，37℃，50 mL/L CO2保持饱和湿度培养.

1.2.2MTT法检测不同浓度Res对C33A，SiHa和HeLa细胞的生长抑制作用取处于对数生长期的C33A，SiHa和HeLa细胞，调整细胞密度为(6~8)×107/L，接种于96孔板，每孔100 μL，细胞贴壁后，实验组加入不同浓度的Res 100 μL，使其终浓度分别为12.5，25，50，100，200，300，400，600 μmol/L；同时设置空白对照组、溶剂对照组和调零孔，每个剂量设3个平行孔. 培养板放回孵箱继续培养24，48，72 h. 取出培养板，每孔加入新鲜配置的MTT 20 μL（浓度为5 g/L），继续培养4 h，吸弃上清液，加入DMSO 150 μL，在平板摇床摇10 min（60次/min）后，用酶联仪于490 nm处测出个孔吸光度值（A 值）. 细胞抑制率（%）=（1-实验组A值/对照组A值）×100%. 实验重复3次.

1.2.3流式细胞仪（FCM）Annexin V荧光染色检测细胞凋亡以0，200，300 μmol/L Res处理细胞48 h，分别消化收集各组细胞，调整细胞密度至1×1010 /L各取100 μL；PBS洗涤2次后，弃上清液；加入500 μL结合缓冲液悬浮细胞；加入5  μL Annexin VEGFP混匀后，加入5 μL PI，混匀；室温、避光染色15 min后，进行荧光显微镜和流式细胞仪的观察和检测，分析细胞凋亡的百分比. 实验重复3次.

1.2.4流式细胞仪PI染色检测细胞周期  消化收集各组细胞，培养24 h，再将细胞饥饿24 h（即加入不含血清的培养液）后，以0，200，300 μmol/L Res处理细胞48 h，分别消化收集各组细胞，调整细胞密度至1×1010/L各取100 μL；PBS洗涤2次后，弃上清液；加入预冷的700 mL/L乙醇固定1 h，离心，PBS洗涤2 次，加入RNAase，37℃水浴30 min后加PI染色15 min，离心后流式细胞仪检测细胞周期. 实验重复3次.

1.2.5荧光显微镜观察将300 μmol/L Res处理细胞48 h后染色：加入5 μL Annexin VEGFP，10 μL PI混匀，室温、避光反应15 min. 进行激光共聚焦显微镜下凋亡细胞形态检测与观察.
统计学处理：所有数据用x±s表示，采用方差分析进行组间比较分析. P<0.01为差异有统计学意义.

2结果

2.1Res对人宫颈癌C33A，SiHa和HeLa细胞的生长抑制作用Res在50 μmol/L以下对宫颈癌细胞的生长无统计学影响，Res在100~600 μmol/L浓度范围内，以浓度和时间依赖的方式抑制宫颈癌C33A细胞的生长（P<0.01）. Res在200~600 μmol/L浓度范围内，以浓度和时间依赖的方式抑制宫颈癌SiHa细胞的生长（P<0.01）. Res在50~600 μmol/L浓度范围内，以浓度和时间依赖的方式抑制宫颈癌HeLa细胞的生长（P<0.01，图1）.  表1白藜芦醇诱导3种细胞的凋亡作用

2.3荧光显微镜观察300 μmol/L Res处理细胞48h后的细胞可见到典型的细胞凋亡性改变，细胞核缩小，染色质凝集，细胞表面形成突起，突起内可见被包裹的细胞质与细胞器、核的碎片或整个浓缩的细胞核，部分突起与细胞脱离，形成凋亡小体（图3）.

2.4Res对人宫颈癌C33A，SiHa和HeLa细胞周期的影响 经0，200，300 μmol/L Res处理48 h后，细胞周期的改变无明显差异. C33A的细胞周期G1期分别(43.66±5.37)%，(45.08±5.33)%, (49.39±6.27)%. G2期分别为(8.95±1.21)%, (3.14±0.87)%, (5.80±0.27)%. S期为(47.38±7.55)%, (51.51±7.24)%, (44.81±4.58)%.  SiHa的细胞周期G1期分别为(73.75±6.75%), (79.27±8.45%), (79.22±8.90)%. G2期分别为(7.53±1.57)%, (3.83±0.83%), (3.71±0.47)%. S期为(18.72±2.50)%, (16.90±3.02)%, (17.07±3.17)%. HeLa的细胞周期G1期分别为(67.62±7.63)%, (72.35±8.42)%, (73.64±8.59)%. G2期为(11.94±1.98)%, (8.71±1.53)%, (6.56±1.05)%. S期为(20.54±3.85)%, (18.85±2.74)%, (19.79±3.34)%.

3讨论

Res又称芪三酚, 它是非黄酮类的多酚化合物,化学名称为(E)3, 4, 5三羟基二苯乙烯，分子式为C14H12O3，相对分子质量为228.25,有游离态（顺式、反式）和糖苷结合态（顺式、反式）两种活性形式. Res是葡萄属植物产生的一种植物抗毒素，广泛存在于自然界中，是植物在受到外来侵害时所产生的抗体性物质，具有抗氧化活性、抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化、抗炎、雌激素样活性、免疫调节及抗肿瘤活性等. 进一步研究发现，Res通过多种机制发挥其抗肿瘤作用，可显著抑制多种人类肿瘤细胞的生长、诱导肿瘤细胞凋亡［1-9］.

A:HeLa; B:C33A; C: SiHa.
图3Res作用48 h后荧光显微镜下3种细胞的凋亡改变×100
本研究通过MTT法检测表明，在一定的浓度范围内，Res对宫颈癌细胞的生长具有明显的抑制作用，在对C33A, SiHa, HeLa三种细胞的作用中，对HPV()的C33A细胞的生长抑制作用最为明显. 在HPV(+)的两种细胞中，对HeLa细胞（腺癌）的抑制作用较SiHa(鳞癌)明显，这与化疗药物对宫颈腺癌的抑制作用强于宫颈鳞癌有关. AnnexinV是一种分子量为35~36 ku的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸（PS）有高度亲和力，PS从细胞膜脂质双层的内侧迁移至外侧是细胞凋亡级联反应的初始事件，利用AnnexinV高度亲和PS可检测早期凋亡的发生. 本研究中，Annexin V和PI双染提示Res处理宫颈癌细胞48 h后，凋亡细胞数明显增多,进一步证实诱导细胞凋亡是Res杀伤宫颈癌细胞的作用机制之一. 在3种细胞株中，依然是对C33A的诱导凋亡作用最为显著，提示HPV阴性的宫颈癌细胞对化疗药物的敏感性更强.
Res可明显抑制宫颈癌细胞的生长，其抑制途径可能为通过抑制细胞的增殖使细胞生长减缓，也可能是通过诱导细胞凋亡使细胞死亡加快，两者的结局是一致的. 本实验研究表明，Res对3种宫颈癌细胞株的细胞周期无明显抑制作用，它主要是通过诱导细胞凋亡从而达到抑制肿瘤细胞的作用.

细胞凋亡是细胞自身调节的一种程序性死亡过程，它不同于细胞坏死，不引起炎症反应，机体亦不会引发不良反应. 因此，诱导细胞凋亡是研究 治疗肿瘤的重要途径. Res不仅能抑制肿瘤细胞的增殖、诱导凋亡，而且能增强放射诱导的白血病细胞株EOL1凋亡［1］. 在某些肿瘤中，Res是一种潜在的TRAIL敏感剂，通过G1细胞周期捕获和Survivin减少增强TRAIL诱导的凋亡. Survivin的主要生物学功能是抑制凋亡. 细胞凋亡主要有两条途径：死亡受体途径和线粒体途径，均最终通过激活下游效应因子使细胞凋亡. Survivin可以直接黏附于活化的效应因子上，使其不能发挥作用，从而阻断细胞凋亡过程. Survivin在正常宫颈组织中不表达，宫颈癌组织中Survivin高表达，在正常宫颈组织、原位癌与浸润癌中差别有显著性意义. Survivin基因在宫颈癌组织中的表达可能抑制了异常突变的细胞凋亡，扰乱了细胞生长和凋亡途径，促进细胞逃离生长监控，导致肿瘤的发生. Res可通过使Survivin减少以增强TRAIL诱导凋亡的作用，从而达到抑制肿瘤的作用［10］. 在肝癌的联合化疗中，Res与细胞毒化疗药物协同发挥作用，抑制生长、诱导凋亡［11］. 本实验证明Res能通过诱导细胞凋亡以抑制宫颈癌C33A,SiHa,HeLa细胞的生长，表明Res在宫颈癌的治疗中有着良好的临床应用前景，而Res抑制宫颈癌细胞生长及诱导凋亡的具体机制还有待于进一步研究.

摘自：学汇乐 – 学术交流网