【摘要】：目的:目前骨质疏松的发病率逐年上升,已经成为老年人的常见病之一。其原因包括社会文明和经济的快速发展、生活水平的提高、生活方式和习惯的变化,特别是在发达城市和人口老龄化日益严重的地区。
众所周知,骨质疏松症是一种年龄相关的全身性骨病,其特点是骨量逐渐减少,骨质脆性和易发生骨折。
成骨细胞是骨生成的主要功能细胞,参与骨的形成。成骨细胞的活化不足导致与老化相关的骨质疏松症的发生。增加成骨细胞的数量及功能可以促进骨形成,这可以作为预防和治疗骨质疏松症的主要治疗策略。
目前,预防和治疗骨质疏松症的药物治疗关注在促进成骨细胞的增殖和分化上。自噬是真核细胞通过降解和回收受损的大分子或细胞器的主要降解代谢过程。在正常情况下,自噬在大部分细胞上都是处于基础水平的,而在应激等刺激下细胞自噬会被激活以调控细胞生存。最近有大量研究表明,自噬作为一种细胞的生存途径,在维持骨骼稳态方面起着举足轻重的作用,并且这一途径的改变与骨质疏松症的发生有关。
沉默信息转录调节因子1(SIRT1)在抑制肿瘤、维持线粒体稳态、能量代谢、细胞衰老以及细胞死亡等多种生物学功能的调控中发挥着重要的作用。最近研究发现SIRT1在小鼠体内的激活与骨质疏松等多种相关疾病的延迟发病有关。SIRT1的缺失或过表达分别会减少或增加骨量。
近年来,白藜芦醇在抗氧化、抗肿瘤和长寿等方面起着积极有效的作用。此外,虽然白藜芦醇是如何发挥其生物学功能尚不完全清楚,但其对SIRT1的激活已被认为是改善细胞功能和机体健康的重要机制。然而白藜芦醇激活SIRT1作用于成骨细胞的机制仍待进一步阐明。
本研究通过检测细胞内SIRT1,PI3K/Akt/m TOR信号通路及自噬相关蛋白在白藜芦醇处理的骨质疏松大鼠中的表达情况,并进一步通过体外细胞实验,观察了解SIRT1在白藜芦醇处理的糖皮质激素型骨质疏松大鼠成骨细胞中自噬相关蛋白及PI3K/Akt/m TOR信号通路的作用,为临床预防和治疗骨质疏松症提供新的方向。
研究方法:
第一部分:体内动物实验
1、骨质疏松动物模型的建立将20只雄性SD大鼠随机分为三组,即对照组(n=5),骨质疏松组(n=5),骨质疏松+白藜芦醇组(n=10)。其中骨质疏松的大鼠每周两次肌注地塞米松5mg/kg,连续给药6周,诱导骨质疏松,而对照组给予注射等计量的生理盐水对照。
2、各组大鼠骨组织的骨密度,股骨近端孔隙,碱性磷酸酶,骨钙素,SIRT1,自噬相关蛋白及Akt和m TOR通路的变化情况骨质疏松组造模成功后将骨质疏松+白藜芦醇组随机分为低剂量组(n=5)和高剂量组(n=5)。在造模成功后7天,分别灌胃5mg/kg/d和45mg/kg/d(即低剂量组和高剂量组)白藜芦醇。麻醉满意后,用5ml注射器从右侧颈总动脉收集2ml血液样本于离心管中,离心机分离,然后用ELISA法检测各组大鼠的碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(OC)。取出股骨,用于双能X线吸收法及相关软件检测各组大鼠的骨密度及股骨近端孔隙。采用Western blot方法测定各组大鼠的骨标本中SIRT1,LC3,Beclin-1,p-m TOR,t-m TOR,p-Akt及t-Akt蛋白的表达情况。
第二部分:体外细胞实验
1、细胞的培养及处理将小鼠MC3T3-E1成骨细胞株进行体外培养,分别用不同浓度的白藜芦醇(10-8-10-6M)处理成骨细胞48h和用白藜芦醇(50μM)处理成骨细胞后5min,30min,60min,120min后,加入或不加入白藜芦醇,采用RT-PCR及免疫荧光技术检测成骨细胞中SIRT1的表达情况。再将生长良好的成骨细胞株接种于96孔板,分为正常对照度,地塞米松组(DEX),白藜芦醇组(RES),地塞米松+白藜芦醇组,白藜芦醇+尼克酰胺(或PI3K特异性抑制剂或m TOR抑制剂或p38特异性抑制剂或JNK特异性抑制剂),作用48h。
2、检测成骨细胞SIRT1,自噬相关蛋白及PI3K/Akt/m TOR信号通路的变化情况Brd U和MTT法检测各组成骨细胞的增殖和活力。用Western blot检测各组的SIRT1,LC3,Beclin-1,Atg7,TOM20,Hsp60,p-m TOR,t-m TOR,p-Akt,t-Akt,p-p38和p-JNK蛋白表达情况。RT-PCR检测各组LC3和Beclin-1的m RNA的表达情况。利用透射电镜观察成骨细胞线粒体自噬的形态学变化及数量的变化。
结果:
1、在骨质疏松大鼠中,其骨密度与对照组对比明显降低,而予以白藜芦醇治疗的骨质疏松大鼠的骨密度则明显的提高(P0.05)。而且白藜芦醇治疗组的股骨近端孔隙也显著降低(P0.05)。骨质疏松大鼠中血清的ALP和OC明显高于对照组;而予以白藜芦醇治疗后,其骨质疏松大鼠的ALP和OC的表达明显降低(P0.05)。
2、动物实验Western blot结果表明,与对照组相比,骨质疏松大鼠中SIRT1,LC3,Beclin-1的表达明显降低,p-Akt和p-m TOR则明显增高(P0.05),而接受高剂量的白藜芦醇治疗后其SIRT1,LC3,Beclin-1的表达明显增加,p-Akt和p-m TOR则明显降低(P0.05),但各组的t-Akt和t-m TOR无明显表达变化(P0.05)。
3、细胞实验部分,RT-PCR结果显示白藜芦醇剂量依赖性促进成骨细胞的SIRT1 m RNA的表达,且10-6M白藜芦醇具有明显的增强SIRT1的表达(P0.05)。Western blot结果显示白藜芦醇时间依赖性促进成骨细胞SIRT1蛋白的表达,且在60分钟后达到最高峰(P0.05),之后无明显变化。免疫荧光法观察到,予以白藜芦醇处理的成骨细胞中的SIRT1表达明显高于空白组(P0.05)。
4、体外培养成骨细胞Western blot结果发现,地塞米松可降低成骨细胞中SIRT1的表达,白藜芦醇可以促进成骨细胞中SIRT1的表达,而NAM抵消白藜芦醇对成骨细胞中SIRT1表达的影响。Brd U和MTT结果显示,与对照组相比,经地塞米松处理后的细胞的增殖和活力明显降低(P0.05),而经白藜芦醇处理后则显著提高成骨细胞增殖和活力(P0.05)。RT-PCR结果显示,无论是否经过地塞米松处理,经过白藜芦醇处理组的LC3 m RNA和Beclin-1 m RNA的表达均明显升高(P0.05),而NAM处理后则与对照组无明显变化(P0.05)。Western blot结果显示自噬相关蛋白LC3、Beclin-1和Atg7的表达情况与上述结果相一致。
5、通过透射电镜(TEM)结果,地塞米松+白藜芦醇处理组可见比地塞米松处理组的线粒体自噬囊泡增加。Western blot结果显示,与地塞米松处理组相比,经过白藜芦醇处理组的TOM20和Hsp60的蛋白水平明显降低(P0.05),而NAM处理后则与对照组无明显变化(P0.05)。
6、通过Western blot结果,与地塞米松处理组相比,白藜芦醇处理组p-Akt和p-m TOR的活性均下调,而雷帕霉素和LY294002阻断了白藜芦醇对成骨细胞中Akt和m TOR的磷酸化影响,但各组t-Akt和t-m TOR的表达无明显差异(P0.05)。对于有无白藜芦醇干预处理成骨细胞后,p38和JNK的蛋白活性与对照组相比无明显变化。
结论:
1、在骨质疏松大鼠中,接受白藜芦醇治疗后可明显改善大鼠的骨密度和股骨孔隙率,降低大鼠的骨转化率,减少骨量流失。
2、在接受白藜芦醇治疗的骨质疏松大鼠中,其SIRT1及相关自噬蛋白表达明显增加,PI3K/Akt/m TOR信号通路被抑制。表明白藜芦醇对骨质疏松大鼠中可能通过增强SIRT1的活性,调控PI3K/Akt/m TOR信号通路,促进细胞自噬水平的增加,起到保护骨质疏松大鼠的作用。
3、白藜芦醇增加成骨细胞SIRT1的活性,在暴露于地塞米松组的成骨细胞中,白藜芦醇增加SIRT1表达,调控PI3K/Akt/m TOR信号通路,TOM20和Hsp60的活性降低,线粒体自噬水平增加。表明白藜芦醇可增强糖皮质激素型骨质疏松大鼠的成骨细胞内SIRT1蛋白的活性表达,抑制细胞内PI3K/Akt/m TOR信号通路,进而增强细胞内线粒体自噬,提高成骨细胞的增殖和活力。
