NMN通过NAD~+/Sirt3通路改善线粒体功能抑制间充质干细胞衰老的作用研究
成体干细胞衰老是导致组织器官衰老、个体衰老以及老年性疾病的重要原因。其中,骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是研究较早且较为深入的一种成体干细胞,具有广泛的基础研究和临床应用前景。然而,在体外培养传代扩增过程中,MSCs出现的复制性衰老严重限制了其在组织损伤修复及临床治疗中的应用。因此,开发有效的抗衰老药物以延缓干细胞衰老是我们亟待解决的关键问题。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD~+)是细胞能量代谢和氧化应激适应性反应的一个关键辅酶,参与多种代谢途径并影响线粒体功能。线粒体功能障碍是衰老的特征之一,NAD~+耗竭与细胞衰老及能量代谢失调密切相关。
Sirt3是线粒体内NAD~+依赖性去乙酰化酶,对线粒体功能及细胞衰老起重要的调节作用。有研究表明,NAD~+的前体烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)可以提高线粒体NAD~+水平,使NAD~+/NADH比值正常化,进而抑制老龄小鼠肌肉干细胞的衰老并改善其线粒体稳态调节功能。结合我们前期实验,随着MSCs衰老,细胞内NAD~+含量减少,同时伴有Sirt3表达降低,NMN能够抑制Nampt抑制剂FK866诱导的MSCs衰老。
我们提出本研究假说:在MSCs衰老过程中,NMN可能通过NAD~+/Sirt3通路改善线粒体功能并进一步抑制MSCs衰老。然而,衰老MSCs中线粒体功能是否发生异常?NMN能否改善衰老MSCs的线粒体功能?NMN又是如何影响线粒体功能参与调控MSCs衰老?上述问题均不清楚。
目的:
研究NMN对衰老MSCs线粒体功能及细胞衰老的影响,探讨NMN调控干细胞衰老的机制,为有效抗衰老药物的开发,解决应用基础治疗中干细胞不足问题提供实验依据。
方法:
1.以1-2月龄雄性Wistar大鼠为实验动物对象,通过全骨髓贴壁法和体外传代培养法获得P3MSCs(early passage,EP)和P10MSCs(late passage,LP),通过细胞形态学观察、衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性及衰老相关因子p16~(INK4a) mRNA的表达评估细胞衰老,建立体外MSCs复制性衰老模型(以EPMSCs为年轻细胞,LPMSCs为衰老细胞)。
2.通过线粒体形态结构观察,ATP含量、活性氧(ROS)水平、线粒体膜电位及耗氧率的测定,明确衰老MSCs中线粒体功能的变化。
3.利用NAD~+/NADH定量试剂盒测定细胞内NAD~+含量和NAD~+/NADH比值,应用RT-qPCR和Western Blot检测细胞内Sirt3的表达。
4.利用NAD~+的前体小分子NMN处理衰老MSCs,探讨其对线粒体功能及MSCs衰老的影响。
5.利用Sirt3慢病毒过表达或Sirt3抑制剂3-TYP,探讨Sirt3对线粒体功能及MSCs衰老的影响,进一步探讨NMN改善线粒体功能抑制MSCs衰老的分子机制。
结果:
1.与年轻MSCs相比,衰老MSCs形态发生明显变化,细胞呈现铺展状、边界变得模糊,失去立体感,表面积增加而长宽比降低;SA-β-gal阳性细胞明显增多,衰老相关因子p16~(INK4a) mRNA的表达显著上调。
2.衰老MSCs的线粒体功能障碍,表现为:线粒体分布分散,片段化明显;线粒体体积增大,出现空泡,双层膜结构消失,内部嵴断裂;衰老MSCs内ATP含量减少而ROS产生增加,线粒体膜电位及耗氧率(OCR)均降低。
3.NMN使衰老MSCs的细胞形态发生改变,表面积减小而长宽比升高,衰老细胞数目及p16~(INK4a) mRNA的表达均显著下调。NMN能够改善衰老MSCs线粒体功能,线粒体分布变得集中,衰老细胞内ATP含量和线粒体膜电位均升高,而ROS水平降低。
4.与年轻MSCs相比,衰老MSCs中NAD~+含量、NAD~+/NADH比值及Sirt3表达均降低;NMN处理后衰老MSCs中NAD~+含量增加,NAD~+/NADH比值升高,Sirt3表达也上调。
5.过表达Sirt3能够有效改善衰老MSCs线粒体功能障碍,使衰老细胞的线粒体形态趋向正常,细胞内ATP含量、线粒体耗氧率(OCR)显著升高,而ROS水平明显降低;过表达Sirt3使衰老MSCs中衰老细胞数目减少,衰老相关因子p16~(INK4a) mRNA的表达明显下调,具有抑制MSCs衰老的作用。在年轻MSCs中,Sirt3抑制剂3-TYP能够导致细胞线粒体功能障碍,促进MSCs衰老。
6.在衰老MSCs中,3-TYP可以使NMN引起的趋于正常的线粒体形态发生异常,下调NMN所致的细胞内ATP含量及线粒体膜电位的升高,并且逆转ROS水平的降低;3-TYP能够逆转衰老MSCs中NMN所致的衰老细胞阳性率及P16~(INK4a) mRNA表达的下降。在年轻MSCs中,NMN也能够改善或抑制3-TYP引起的线粒体功能障碍和细胞衰老。
结论:
- 1.衰老MSCs的线粒体功能障碍,NAD~+含量及Sirt3表达显著降低。
- 2.过表达Sirt3能够改善衰老MSCs的线粒体功能,抑制MSCs衰老;Sirt3抑制剂3-TYP发挥了相反作用。
- 3.NMN能够改善衰老MSCs的线粒体功能,抑制MSCs衰老,该调控作用是通过上调细胞内NAD~+含量及Sirt3表达实现的。
机 构: 吉林大学
文章来源：https://wap.cnki.net/touch/web/Dissertation/Article/10183-1020905751.nh.html
